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熒光顯微鏡技術的基本原理是借助熒光劑讓細胞成分呈現高度具體的可視化效果，比如在目的蛋白后面連一個通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中，目的基因無法進行克隆，則需要用免疫熒光染色等其他技術手段來觀察目的蛋白。為此，就需要利用抗體，這些抗體連接各種不同的熒光染料，直接或間接地與相應的靶結構相結合。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡技術不只局限于蛋白質，它還可以對核酸、聚糖等其他結構進行染色，即便鈣離子等非生物物質也可以檢測出來。本文就對幾種常用的熒光劑進行了具體的介紹。
免疫熒光 (IF)
在熒光顯微鏡技術中，可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：利用內源熒光信號，即通過克隆手段，用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連；或利用熒光標記的抗體特異性結合目的蛋白。有些生物學問題采用第二種方法會更有用或更有必要。比如，組織學樣品無法使用熒光蛋白，因為通常來說，標本都是從無法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外，當有一個有功能的抗體可用時，免疫熒光法會比熒光蛋白技術快很多，因為后者必須先克隆目的基因再將DNA轉染到適當的細胞中。熒光蛋白的另一項劣勢在于其本身屬于蛋白質。因此，細胞內的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質特性，其會導致附著的目的蛋白質發生功能紊亂或出現誤釋的情況。然而，熒光蛋白技術仍然是觀察活細胞的首選方法。
免疫熒光法利用了抗體可以和相應抗原特異性結合的這個特性，對此它還有兩種不同的表現形式。最簡單的方式是使用可與目的蛋白相結合的熒光標記抗體。這種方法被稱為“直接免疫熒光法”。
在很多情況下，我們可以利用兩種不同特性的抗體。第一種抗體可以結合目的蛋白，但其本身并未進行熒光標記（一抗）。第二種抗體本身就攜帶熒光染料（二抗），并且可以特異性結合一抗。這種方法被稱為“間接免疫熒光法”。這種方法存在諸多優勢。一方面，它會產生放大效應，因為不只一個二抗可以與一抗相結合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標記目的蛋白的每個抗體，但可以使用市售熒光標記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括 FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料，下文均有提及。
FITC 和 TRITC
異硫氰酸熒光素(FITC) 是一種有機熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細胞術中。在 495/517 nm 處，該染料會產生激發/發射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應基團與不同抗體結合，該基團可以和蛋白質上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團相結合。而它的基本成分—— 熒光素，其摩爾質量為 332 g/mol，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389 g/mol) 是用于熒光顯微鏡技術的首批染料，且其被當成 Alexa Fluor?488 等后續熒光染料的發端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統，而該系統受藍色光譜中的光所激發。
經常與 FITC 同時使用的另一種染料是與其相似的TRITC [四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與 FITC 相反，TRITC 并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統，正是該系統引發了它們的熒光行為。還有一點與FITC 相反，TRITC (479 g/mol) 由最大波長為 550nm的綠色光譜中的光所激發，它的最大發射波長為 573 nm。與蛋白質（例如，抗體）結合也基于異硫氰酸鹽反應基團。
雖然 FITC 和 TRITC 仍在使用，但由于它們屬于發光相對較弱的熒光染料且它們的優勢僅僅是經濟實惠，因此，在最新的顯微鏡技術中并不推薦。
青色素
這類熒光染料相對較少，從青色素衍生而來，也是其名稱的由來：Cy2、Cy3、Cy5 和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反應基團與核酸或蛋白相連。例如，采用了蛋白標記的馬來酰亞胺基團。有趣的是，對于熒光，Cy5 對其周邊電子環境非常敏感，該特征可用于酶測定。附著蛋白質的構象改變會導致熒光發射產生陽性或陰性變化。此外，Cy3 和 Cy5 還可用于 FRET 試驗。青色素染料是一種相對較老的熒光染料，但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產率等方面得以改善的基礎。
Alexa Fluor?染料
Alexa Fluor?染料是帶負電荷且親水的熒光染料系列，該系列染料囊括范圍較廣，且經常用于熒光顯微鏡技術之中。這些染料的名稱是由其發明者Richard Paul Haugland 以他兒子 Alex Haugland 的名字命名的。該產品標識是 Molecular Probes（美國生命科學技術公司 Life Technologies旗下子公司，注：2014年2月Life Technologies被Thermo Fisher收購）的商標。此外，這些產品標識中也涵蓋了相應的激光激發波長。例如，應用范圍很廣且最大激發波長為 493 nm的Alexa Fluor?488，可由標準的488 nm激光激發。Alexa Fluor?488的最大發射波長為 519 nm，正是因為具備上述特性，使得 Alexa Fluor?488與 FITC 的屬性相似。盡管 Alexa Fluor?488是一種熒光素衍生物，但與 FITC 相反，它擁有更佳的穩定性和熒光亮度，且 pH 敏感度也更低。所有 Alexa Fluor? 染料（比如，Alexa Fluor?546、Alexa Fluor?633）都是不同基礎熒光物質的磺化形式，例如，熒光素、香豆素、青色素或羅丹明，它們的摩爾質量在410 至 1400 g/mol 范圍之內。
DNA 染色
在熒光顯微鏡技術中，不只研究蛋白結構，核酸同樣具有重要的研究意義。有時候，必須通過檢測細胞核來確定細胞的精確位置及其數量。最常用的一種DNA 染色劑當屬 DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚) ，其可與DNA 雙螺旋的 A-T 富集區域相結合。如果 DAPI 附著到 DNA 上，其熒光強度將比游離狀態要高。該染色劑受最大波長為358 nm的紫外光激發，其發射光譜非常寬，在461 nm 處達到峰值。此外，還可對弱熒光進行 RNA 結合檢測。在這種情況下，發射波長將轉移至 500 nm。有趣的是，DAPI 能夠穿透整個細胞膜。因此，它可以用于固定和活細胞之中。
第二種被廣泛使用的DNA 染色劑就是 Hoechst 染料系列，這些染料原先都是由 Hoechst AG 這家化學公司生產的。Hoechst 33258、Hoechst 33342以及Hoechst 34580 均為雙苯酰亞胺，可嵌入 A-T 富集區域，因此，該系列染料很少用到。與 DAPI 相似，這三種染色劑都可受最大發射波長為455 nm的紫外光激發，而未被結合的染色劑，其最大發射波長在 510–540 nm 之間。Hoechst 染色劑還具有細胞滲透性，因此可用于活細胞或已固定的細胞中。該染色劑與DAPI 的不同之處在于，它們的毒性較低。
碘化丙啶（Propidium-Iodide，PI）是一種不能透過細胞膜的 DNA 染色劑。由于具備上述特性，該染色劑無法進入完整的細胞中，因此，該染色劑常用于區分細胞群中的活細胞和死細胞。此外，碘化丙啶還是一種嵌入劑，但對于不同的堿基并不存在結合的差異性。該染色劑與核酸結合后，最大激發波長為538 nm，最大發射波長為 617 nm。未結合 PI 的最大激發和發射波長和光強會更低一些。PI 還可結合 RNA，同時無需改變自身的熒光特性。有時候為了區分DNA 和 RNA，有必要使用適當的核酸酶。
不需要前期處理，吖啶橙就可以鑒別DNA 與 RNA 。吖啶橙與 DNA 結合后，最大激發/發射波長為 502 nm/525 nm，而與 RNA 結合后，最大激發/發射波長為460 nm/650 nm。此外，它還能夠進入溶酶體等酸性區室。在這里，陽離子染料被質子化。在這種酸性環境下，吖啶橙由藍色光譜中的光激發，但發射波長在橙色區域達到最大。由于凋亡細胞具有大量被吞噬的酸性區室，因此，吖啶橙常用作此類細胞的標記物。
區室和細胞器特異性染料
在熒光顯微鏡技術中，往往要對溶酶體、核內體等細胞區室以及線粒體等細胞器進行染色。為此，該部分介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。
觀察線粒體最常用的方法就是利用 MitoTracker?，它是一種可透過細胞的染料，包含輕度巰基化的氯甲基活性部分。正因如此，它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反應，從而與基質蛋白實現共價結合。MitoTracker? 有不同的顏色和修飾類型（參見表 1），此外，它還是 Molecular Probes 的商標。與羅丹明 123 (Rh123) 或 tetramethylrosamine等常規線粒體特異性染色劑不同，在用固定劑破壞膜電位后，MitoTracker?不會被洗掉。
依據線粒體染色劑，還有些染料可以標記溶酶體等酸性區室，這類染料被稱為LysoTracker。它們由連接一個熒光基團的弱堿基團組成，具有膜穿透性。最有可能的情況是，這些堿基因質子化作用的影響而對酸性區室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇（參見表 1）。
與溶酶體相似的區室是釀酒酵母等真菌中的液泡，這種膜密閉空間也是一種酸性環境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區室，則要使用FM 4-64?或FM 5-95?等苯乙烯基染料。
對于蛋白質分泌實驗，內質網 (ER) 具有重要的研究意義。對上述區室進行染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好 ER，但仍會結合線粒體等其他細胞器膜。對ER 進行特異性染色的另一種方法是，使用 ER-Tracker Green 和 Red 等 ER-Tracker，而 ER-Tracker Green 和 Red 是基于 BODIPY 的兩種染料，其與格列本脲（一種磺?；迕福┻B接，并可與僅存于內質網膜上的ATP敏感性鉀通道結合。BODIPY（硼-二吡咯亞甲基，boron-dipyrromethene）是一種幾乎不溶于水的、對pH 相對不敏感的染料基團，該染料對蛋白質標記沒太大用處，但卻是脂質和膜標記的良好工具。
對于與ER相鄰的高爾基體，可以用 NBD C6-ceramide 和BODIPYFL C5-ceramide 等熒光神經酰胺類似物對其進行標記。 上述神經酰胺為鞘脂類，其在高爾基體中高度富集。
借助基于脂質的染料，可以對脂筏等特異膜區域進行染色。使用 NBD-6Cholestrol或NBP-12 Cholesterol 可以觀察膽固醇富集區域（Avanti Polar Lipids）。
除了使用特異性非蛋白熒光染料對細胞區室進行標記之外，還可以借助對細胞中不同位置有偏好的蛋白質對目標區域進行染色。這些蛋白質可以和熒光染料相連，并可通過熒光顯微鏡進行觀察。運用這種方法的一個實例是：麥胚凝集素(WGA) 可以與細胞質膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結合，將WGA 與熒光染料偶聯，這樣我們就可以觀察到細胞質膜了。
離子成像
在有關神經元方面的研究中，觀察基因活性或細胞運動等對于了解細胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對很多不同的細胞活動都具有較大影響。一般情況下，借助熒光標記的螯合劑可將離子困住，螯合劑在結合相應離子后會改變離子的光譜特性。例如，利用該原理的鈣指示劑fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4和Calcium-Green 等。
對于鈉離子的檢測，通常使用 SBFI (sodium-bindingbenzofurzanisophthalate) 或Sodium Green。PBFI(potassium-binding benzofurzanisophthalate) 可以檢測鉀離子。
有趣的是，還存在以蛋白質為主的鈣指示劑，其中一種是基于水母化學發光蛋白—水母素。水母素、發光體腔腸素、分子氧和 Ca2+的相互作用會釋放藍光，這是在熒光蛋白質的發現過程中非常著名的機制。
熒光染料及其激發和發射波長峰值
上文提到的所有染料在下表中均有統計。此外，還涵蓋了其他熒光染料及其激發和發射波長峰值。
熒光染料示例
激發光
Indo-1, Ca saturated
331 nm
Indo-1 Ca2+
346 nm
Cascade Blue BSA pH 7.0
401 nm
Cascade Blue
398 nm
LysoTracker Blue
373 nm
Alexa 405
401 nm
LysoSensor Blue pH 5.0
374 nm
LysoSensor Blue
374 nm
DyLight 405
399 nm
DyLight 350
332 nm
BFP (Blue Fluorescent Protein)
380 nm
Alexa 350
343 nm
7-Amino-4-methylcoumarin pH 7.0
346 nm
Amino Coumarin
345 nm
AMCA conjugate
347 nm
Coumarin
360 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin
360 nm
7-Hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0
361 nm
6,8-Difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin pH 9.0
358 nm
Hoechst 33342
352 nm
Pacific Blue
404 nm
Hoechst 33258
352 nm
Hoechst 33258-DNA
352 nm
Pacific Blue antibody conjugate pH 8.0
404 nm
PO-PRO-1
434 nm
PO-PRO-1-DNA
435 nm
POPO-1
433 nm
POPO-1-DNA
433 nm
DAPI-DNA
359 nm
DAPI
358 nm
Marina Blue
362 nm
SYTOX Blue-DNA
445 nm
CFP (Cyan Fluorescent Protein)
434 nm
eCFP (Enhanced Cyan Fluorescent Protein)
437 nm
1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid (1,8-ANS)
375 nm
Indo-1, Ca free
346 nm
1,8-ANS (1-Anilinonaphthalene-8-sulfonic acid)
375 nm
BO-PRO-1-DNA
462 nm
BOPRO-1
462 nm
BOBO-1-DNA
461 nm
SYTO 45-DNA
451 nm
evoglow-Pp1
448 nm
evoglow-Bs1
448 nm
evoglow-Bs2
448 nm
Auramine O
431 nm
DiO
487 nm
LysoSensor Green pH 5.0
447 nm
Cy 2
489 nm
LysoSensor Green
447 nm
Fura-2, high Ca
336 nm
Fura-2 Ca2+sup>
336 nm
SYTO 13-DNA
488 nm
YO-PRO-1-DNA
491 nm
YOYO-1-DNA
491 nm
eGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein)
488 nm
LysoTracker Green
503 nm
GFP (S65T)
489 nm
BODIPY FL, MeOH
502 nm
Sapphire
396 nm
BODIPY FL conjugate
503 nm
MitoTracker Green
490 nm
MitoTracker Green FM, MeOH
490 nm
Fluorescein 0.1 M NaOH
493 nm
Calcein pH 9.0
494 nm
Fluorescein pH 9.0
490 nm
Calcein
493 nm
Fura-2, no Ca
367 nm
Fluo-4
494 nm
FDA
495 nm
DTAF
495 nm
Fluorescein
495 nm
Fluorescein antibody conjugate pH 8.0
493 nm
CFDA
495 nm
FITC
495 nm
Alexa Fluor 488 hydrazide-water
493 nm
DyLight 488
493 nm
5-FAM pH 9.0
492 nm
FITC antibody conjugate pH 8.0
495 nm
Alexa 488
493 nm
Rhodamine 110
497 nm
Rhodamine 110 pH 7.0
497 nm
Acridine Orange
431 nm
Alexa Fluor 488 antibody conjugate pH 8.0
499 nm
BCECF pH 5.5
485 nm
PicoGreendsDNA quantitation reagent
502 nm
SYBR Green I
498 nm
Rhodaminen Green pH 7.0
497 nm
CyQUANT GR-DNA
502 nm
NeuroTrace 500/525, green fluorescent Nissl stain-RNA
497 nm
DansylCadaverine
335 nm
Rhodol Green antibody conjugate pH 8.0
499 nm
Fluoro-Emerald
495 nm
Nissl
497 nm
Fluorescein dextran pH 8.0
501 nm
Rhodamine Green
497 nm
5-(and-6)-Carboxy-2', 7'-dichlorofluorescein pH 9.0
504 nm
DansylCadaverine, MeOH
335 nm
eYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein)
514 nm
Oregon Green 488
498 nm
Oregon Green 488 antibody conjugate pH 8.0
498 nm
Fluo-3
506 nm
BCECF pH 9.0
501 nm
SBFI-Na+
336 nm
Fluo-3 Ca2+
506 nm
Rhodamine 123, MeOH
507 nm
FlAsH
509 nm
Calcium Green-1 Ca2+
506 nm
Magnesium Green
507 nm
DM-NERF pH 4.0
493 nm
Calcium Green
506 nm
Citrine
515 nm
LysoSensor Yellow pH 9.0
335 nm
TO-PRO-1-DNA
515 nm
Magnesium Green Mg2+
507 nm
Sodium Green Na+
507 nm
TOTO-1-DNA
514 nm
Oregon Green 514
512 nm
Oregon Green 514 antibody conjugate pH 8.0
513 nm
NBD-X
466 nm
DM-NERF pH 7.0
509 nm
NBD-X, MeOH
467 nm
CI-NERF pH 6.0
513 nm
Alexa 430
431 nm
Alexa Fluor 430 antibody conjugate pH 7.2
431 nm
CI-NERF pH 2.5
504 nm
Lucifer Yellow, CH
428 nm
LysoSensor Yellow pH 3.0
389 nm
6-TET, SE pH 9.0
521 nm
Eosin antibody conjugate pH 8.0
525 nm
Eosin
524 nm
6-Carboxyrhodamine 6G pH 7.0
526 nm
6-Carboxyrhodamine 6G, hydrochloride
525 nm
Bodipy R6G SE
528 nm
BODIPY R6G, MeOH
528 nm
6 JOE
520 nm
Cascade Yellow antibody conjugate pH 8.0
399 nm
Cascade Yellow
399 nm
mBanana
540 nm
Alexa Fluor 532 antibody conjugate pH 7.2
528 nm
Alexa 532
528 nm
Erythrosin-5-isothiocyanate pH 9.0
533 nm
6-HEX, SE pH 9.0
534 nm
mOrange
548 nm
mHoneydew
478 nm
Cy 3
549 nm
Rhodamine B
543 nm
DiI
551 nm
5-TAMRA-MeOH
543 nm
Alexa 555
553 nm
Alexa Fluor 555 antibody conjugate pH 7.2
553 nm
DyLight 549
555 nm
BODIPY TMR-X, SE
544 nm
BODIPY TMR-X, MeOH
544 nm
PO-PRO-3-DNA
539 nm
PO-PRO-3
539 nm
Rhodamine
551 nm
Bodipy TMR-X conjugate
544 nm
POPO-3
533 nm
Alexa 546
562 nm
BODIPY TMR-X antibody conjugate pH 7.2
544 nm
Calcium Orange Ca2+
549 nm
TRITC
550 nm
Calcium Orange
549 nm
Rhodaminephalloidin pH 7.0
558 nm
MitoTracker Orange
551 nm
MitoTracker Orange, MeOH
551 nm
Phycoerythrin
565 nm
Magnesium Orange
550 nm
R-Phycoerythrin pH 7.5
565 nm
5-TAMRA pH 7.0
553 nm
5-TAMRA
549 nm
Rhod-2
552 nm
FM 1-43
472 nm
Rhod-2 Ca2+
553 nm
Tetramethylrhodamine antibody conjugate pH 8.0
552 nm
FM 1-43 lipid
473 nm
LOLO-1-DNA
568 nm
dTomato
554 nm
DsRed
563 nm
Dapoxyl (2-aminoethyl) sulfonamide
372 nm
Tetramethylrhodamine dextran pH 7.0
555 nm
Fluor-Ruby
554 nm
Resorufin
571 nm
Resorufin pH 9.0
571 nm
mTangerine
568 nm
LysoTracker Red
578 nm
Lissaminerhodamine
572 nm
Cy 3.5
578 nm
Rhodamine Red-X antibody conjugate pH 8.0
573 nm
Sulforhodamine 101, EtOH
578 nm
JC-1 pH 8.2
593 nm
JC-1
592 nm
mStrawberry
575 nm
MitoTracker Red
578 nm
MitoTracker Red, MeOH
578 nm
X-Rhod-1 Ca2+
580 nm
Alexa Fluor 568 antibody conjugate pH 7.2
579 nm
Alexa 568
576 nm
5-ROX pH 7.0
578 nm
5-ROX (5-Carboxy-X-rhodamine, triethylammonium salt)
578 nm
BO-PRO-3-DNA
574 nm
BOPRO-3
574 nm
BOBO-3-DNA
570 nm
Ethidium Bromide
524 nm
ReAsH
597 nm
Calcium Crimson
589 nm
Calcium Crimson Ca2+
590 nm
mRFP
585 nm
mCherry
587 nm
Texas Red-X antibody conjugate pH 7.2
596 nm
HcRed
590 nm
DyLight 594
592 nm
Ethidium homodimer-1-DNA
528 nm
Ethidiumhomodimer
528 nm
Propidium Iodide
538 nm
SYPRO Ruby
467 nm
Propidium Iodide-DNA
538 nm
Alexa 594
590 nm
BODIPY TR-X, SE
588 nm
BODIPY TR-X, MeOH
588 nm
BODIPY TR-X phallacidin pH 7.0
590 nm
Alexa Fluor 610 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2
567 nm
YO-PRO-3-DNA
613 nm
Di-8 ANEPPS
469 nm
Di-8-ANEPPS-lipid
469 nm
YOYO-3-DNA
612 nm
Nile Red-lipid
553 nm
Nile Red
559 nm
DyLight 633
624 nm
mPlum
587 nm
TO-PRO-3-DNA
642 nm
DDAO pH 9.0
648 nm
Fura Red, high Ca
434 nm
Allophycocyanin pH 7.5
651 nm
APC (allophycocyanin)
650 nm
Nile Blue, EtOH
631 nm
TOTO-3-DNA
642 nm
Cy 5
646 nm
BODIPY 650/665-X, MeOH
646 nm
Alexa Fluor 647 R-phycoerythrin streptavidin pH 7.2
569 nm
DyLight 649
652 nm
Alexa Fluor 647 antibody conjugate pH 7.2
653 nm
Alexa 647
653 nm
Fura Red Ca2+
435 nm
Atto 647
644 nm
Fura Red, low Ca
472 nm
Carboxynaphthofluorescein pH 10.0
600 nm
Alexa 660
664 nm
Alexa Fluor 660 antibody conjugate pH 7.2
663 nm
Cy 5.5
673 nm
Alexa Fluor 680 antibody conjugate pH 7.2
679 nm
Alexa 680
679 nm
DyLight 680
678 nm
Alexa Fluor 700 antibody conjugate pH 7.2
696 nm
Alexa 700
696 nm
FM 4-64, 2% CHAPS
506 nm
FM 4-64
508 nm
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